Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist wohl die wichtigste neue molekularbiologische Methode der letzten 10 Jahre. Heute ist die PCR eine fundamentale Technik mit ständig neuen Anwendungen. Zentral für die PCR ist die Wechselwirkung von Polymerasen mit DNA. Die Details dieser Wechselwirkung, vor allem deren Abhängigkeiten von: Puffer, Temperatur oder Primersequenz sind leider bis heute nur unvollständig verstanden. Die Ausarbeitung der richtigen Reaktionsbedingungen ist daher schwierig und mit viel trial and error verbunden.
Im PCR Protokoll wird zunächst ein DNA-Doppelstrang aufgeschmolzen. In Gegenwart einer großen Menge an passenden Primersträngen wird die Reaktionslösung langsam abgekühlt. Bedingt durch die sehr hohe Primärkonzentration wird eine Annelierung der DNA-Stränge mit den Primersträngen A und B erreicht. Anschließend wird die Reaktionsmischung auf ca. 72°C erhitzt. Das ist die optimale Arbeitstemperatur für die thermostabilen Polymerasen (TAQ-Polymerase). Die Primerstränge werden von der Polymerase mit Hilfe der Triphosphate verlängert. Man hat so die Menge an DNA verdoppelt. Der Zyklus beginnt nun von vorne. Insgesamt wird so ein exponentielles Wachstum (Vermehrung) der DNA erreicht. Die replizierte DNA nennt man Amplikon.
In die PCR kann auch eine Mischung verschiedener DNA-Stränge eingesetzt werden. Durch die Wahl der Primersequenzen kann aus einem solchen DNA-Mix die gewünschte Sequenz herausvervielfältigt werden. Die Basis ist die hochselektive Vermehrung der von den Primersträngen erkannten DNA-Stränge.
Eine Vermehrung ist bis maximal ca. 10-100 nM Amplikon möglich, ab dann tritt oft Zersetzung der Polymerase ein, die ständig zwischen den verschiedenen, z.T. hohen Temperaturen rezykliert wird. Gleichzeitig nimmt die Primerkonzentration ab, so dass die Konkurrenzreaktion, nämlich die Bildung von Doppelsträngen stärker in den Vordergrund tritt.
Was kann heute mit PCR erreicht werden:
Mit PCR können sehr kleine DNA-Mengen (1 Molekül reicht) gereinigt und vermehrt werden
Für die Vermehrung ist nur ein partielles Wissen der Gesamtsequenz notwendig.
Die Technik ist sehr schnell. Thermostabile Polymerasen und Temperaturzykler sind kommerziell erhältlich.
Die Anwendung der PCR auf cDNA Bibliotheken ermöglicht Genexpressionstudien. Reverse Transkription (RT) und PCR lassen sich miteinander koppeln. Das gelingt z. B. mit Polymerasen die auch RT-Aktivität besitzen.
Mit PCR lässt sich die Menge einer bestimmten mRNA im Cytoplasma ermitteln. Hierzu ist es notwendig die sogenannte copy number zu bestimmen. Das ist die Zahl der durchgeführten Amplifikationsschritte.
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