Das Design von Biomolekülen mit definierten Strukturen und Funktionen ist bis heute ein unerreichtes Ziel. Wir verstehen weder die Proteinfaltung noch die katalytischen Funktionen vieler Biomoleküle. Statt eines rationalen Design wurden in den letzten Jahren vor allem evolutive Methoden in die Chemie eingeführt. Diese Methoden erlauben die Herstellung einer großen Zahl unterschiedlicher Moleküle auf einen Streich. Aus diesem Molekülpool, man spricht auch von einer Molekülbibliothek, werden dann die Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften durch gezielte Vermehrung herausisoliert. Moleküle konkurrieren also miteinander. Diejenigen, die die Aufgabe am Besten erfüllen werden herausvermehrt, d.h. selektioniert. Die besten Moleküle werden vermehrt und erneut einer Selektion, jetzt unter verschärften Bedingungen unterzogen. Nur die besten werden erneut gezielt vermehrt. Dieser evolutive Prozess wird z. T. bis zu 10 mal wiederholt. Am Ende werden maßgeschneiderte Moleküle erhalten. Evolutive Methoden gelingen besonders leicht nur mit Molekülen wie DNA oder RNA, die mit Hilfe der PCR vermehrbar sind.
Seit der Entdeckung katalytisch aktiver RNA, also von RNA, die in spezifische dreidimensionale Formen faltet und ähnlich einem Protein Reaktionen katalysieren kann, ist vor allem die Selektion neuer Enzyme auf RNA und DNA Basis von sogenannten Ribozymen in den Fordergrund der Forschung gerückt. DNA und RNA Moleküle können, ähnlich wie Antikörper hochspezifisch kleine Moleküle oder Proteine molekular binden. Ein zweites Ziel der evolutiven Methoden ist daher die Erzeugung hochspezifischer Rezeptoren auf DNA oder RNA Basis, die zum Beispiel medizinisch relevante Proteine (Targets) binden können. Diese Rezeptoren nennt man Aptamere. Das Verfahren der Aptamerentwicklung nennt sich SELEX = systematic evolution of ligands by experimental enrichment.
Der erste Schritt beinhaltet die Erzeugung einer Bibliothek. Hierzu wird ein DNA-Synthesizer angewiesen nicht ein Nukleotid an einer bestimmten Stelle zu kuppeln, sondern eine Mischung aus allen vier Phosphoramiditbausteinen. Die randomisierte Sequenz wird in der Mitte zwischen bekannten Sequenzen hergestellt, die für die Primererkennung notwendig sind.
Anschließend wird die Mischung aus bis zu 1015 - 1016 Einzelmolekülen "Individuen" z. B. auf eine Affinitätssäule gegeben. (Eine Säule die mit einem Material gefüllt ist, an das kovalent das zu bindende Target-Molekül angeknüpft ist) Die Mischung läuft durch die Säule. Die RNA-Moleküle, die die angeknüpfte Substanz binden, werden leicht zurückgehalten. Die letzten Rest, der von der Säule gespült wird, wird deshalb aufgefangen und durch PCR vermehrt. Man erhält einen ersten angereicherten Pool an RNA Substanzen. Dieser Pool wird erneut über die Affinitätssäule einer Selektion unterzogen. Hierbei können die Selektionskriterien verschärft werden, in dem z. B. der Lösung mehr Salz zugesetzt wird, was die Bindung schwächt. Nur die stärksten, aktivsten DNA oder RNA Moleküle werden so isoliert und gezielt vermehrt.
Verwendet man RNA, so muss diese natürlich vor der Vermehrung durch PCR in DNA umgeschrieben werden. Hierzu sind die reversen Transkriptasen notwendig. Reverse Transkriptasen sind Enzyme die einen RNA-Strang in einen DNA-Strang kopieren. Ganz am Ende, wenn keine weitere Aktivitätssteigerung mehr erreicht wird, wird die RNA in eine cDNA umgeschrieben und sequenziert. Erst dann ist die Sequenz des "Gewinners" bekannt.
Neben der Selektion von DNA oder RNA Molekülen, die kleine organische Moleküle oder Proteine binden, können auch Oligonukleotide selektioniert werden, die katalytische Funktionen besitzen. Unten findet sich z.B. ein Selektionsschema, das es gestattet Oligonukleotide mit selbstmodifizierenden Eigenschaften zu generieren. Im unteren Beispiel werden aus einer RNA-Bibliothek nur die Moleküle herausgefiltert, die es schaffen sich mit dem in Lösung angebotenen komplementären DNA, oder RNA Strang zu verknüpfen "ligieren". Diese RNA Moleküle werden mit dem an der Säule befindlichen komplementären Oligonukleotid hybridisieren und so zurückgehalten. Die zurückgehaltenen RNA-Moleküle werden isoliert, in DNA umgeschrieben und vermehrt.
Im obigen Beispiel wurde nach jeder Runde der Selektionsdruck, durch Verkürzung der Ligationszeiten erhöht. In diesem Beispiel wurden schon nach nur 3 Runden aktive RNA Moleküle, d.h. RNA-Moleküle, die sich selbst ligieren, isoliert.
Ein besonderer Trick ist es, die Oligonukleotide, die in den Selektions-Runden isoliert werden während der Amplifikation erneut leicht zu verändern. So kann der Pool an aktiven Verbindungen "nachrandomisiert" werden. Das gelingt mit Hilfe der mutagenen PCR. Hier werden die PCR Bedingungen so eingestellt, dass die Polymerase während des Kopiervorganges Fehler macht. Die Fehlerrate z. B. 1 pro 20 Basenpaare kann durch die Wahl der Bedingungen eingestellt werden.
Was bringt die Nachrandomisierung?Die komplette Randomisierung eines 220meren Oligonukleotid würde 10132 Varianten (4220) ergeben. Diese Zahl ist nicht realisierbar, da man Tonnen an RNA bräuchte um von jeder möglichen Variante ein Molekül vorliegen zu haben. Man kann "nur" ca. 1015 Moleküle produzieren. Aus diesem limitierten Pool werden die aktivsten isoliert, dann werden sie durch mutagene PCR erneut leicht verändert. Man sagt, der Pool evolviert oder man such dann in einem lokal begrenzten Sequenzraum.
Diese Art der Auffindung aktiver Oligonukleotide ist vor allem bei Forschern, die sich für präbiotische Chemie (siehe Kapitel 4) interessieren auf großen Interesse gestoßen. Man geht heute davon aus, das die ersten Lebensformen auf der Erde kleine selbstreplizierende RNA-Sequenzen waren. Mit der Methode gelingt es nun möglicherweise solche RNA-Moleküle zu erzeugen um sie dann studieren zu können. Evolution im Reagenzglas könnte uns helfen die Entwicklung des Lebens auf der Erde nachzustellen, so der Traum einiger Forschergruppen.
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